IMPORTANTE: leer las recomendaciones acerca del funcionamiento de cada servicio.


ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA: MICROARRAYS 2 COLORES

 

Introducción

La característica principal de esta plataforma es que la hibridación entre RNAs de las muestras control y experimental es de tipo competitiva ya que ambas muestras son colocadas al mismo tiempo sobre el mismo soporte. Para distinguirlas a cada una de las muestras se le acopla un fluoróforo diferente (habitualmente Cy3 y Cy5). Tras la hibridación, la intensidad es detectada y cuantificada por un escáner. Con los datos numéricos de las intensidades el software específico del escáner genera la imagen del microarray. Es esta imagen la que es analizada visualmente para la detección y corrección de posibles imperfecciones que hubieran surgido durante el procesamiento. Los datos así obtenidos son procesados de nuevo para eliminar al máximo cualquier tipo de variación de causa experimental (normalización). El tratamiento estadístico de éstos permite asignar a cada sonda interrogada una probabilidad indicativa de la confianza en  la variación observada entre los valores de muestras control y experimental.

 


Que ofrecemos

El servicio de microarrays de dos colores realiza hibridaciones para organismos eucariotas y procariotas:

1- Arrays propios: La Unidad puede imprimir microarrays de hasta 25000 puntos de colecciones de oligonucleótidos o productos de PCR que el usuario proporcione. Consultar con la Unidad para más información.

2- Arrays comerciales: Habitualmente la Unidad de Genómica se encarga de localizar y conseguir microarrays en los que el usuario esté interesado. Se recomienda al usuario que contacte con la unidad para asesoramiento sobre diferentes casas comerciales.

3- Arrays suministrados por el usuario: El usuario podrá proveer microarrays propios con la obligación de suministrar ficheros adjuntos para su análisis que describa el array para su cuantificación. En estos casos se recomienda proporcionar toda la información que el fabricante aporte sobre el procesamiento de estos.

La Unidad cuenta con un stock de los siguientes arrays comerciales:

Humano- Homo sapiens: 22.102 oligonucleótidos de 70mer de Operon_Human_v2 http://microarray.uc.edu/Products/PRODUCTS.HTM

Ratón- Mus musculus 31.769 oligonucleótidos de 70mer de Operon_Mouse_oligo_Lib_13443 http://microarray.uc.edu/Products/PRODUCTS.HTM

Rata- Ratus norvegicus: 26.962 oligonucleótidos de 70mer de rat_v3.0.3 http://microarray.uc.edu/Products/PRODUCTS.HTM

Arabidopsis thaliana: 29.000 oligonucleótidos de 70 mer de Arabidopsis Oligonucleotide Microarrays, (Qiagen-Operon Arabidopsis Genome Array Ready Oligo Set (AROS) Version 3.0.) impresos en la universidad de Arizona  http://ag.arizona.edu/microarray/

Tomate- Solanum lycopersicum: Aproximadamente 12.000 cDNAs (13.440 spots por array). http://bti.cornell.edu/CGEP/CGEP.html

Patata- Solanum tuberosum: 15.264 cDNAs de los secuenciados por TIGR en colaboración con otros como el tNSF Potato Functional Genomics Project. http://www.tigr.org/tdb/potato/microarray_comp.shtml

Arroz - Oryza sativa: 45.000 oligos de 70mer de Rice Oligonucleotide Microarrays (oligos diseñados y producidos por el NSF Rice Oligonucleotide Array Project ) http://www.ag.arizona.edu/microarray/ROM.html

Medicago truncatula: 16.086 oligonucleótidos de 70mer (Mt16kOLI1 oligonucleotide) (Medicago Genome Oligo Set Version 1.0 Upgrade, Operon) http://www.cebitec.uni-bielefeld.de/groups/glp/microarrays/

Escherichia coli: 4.290 "open reading frames" (ORFs) de productos de PCR anotados en E. coli mg1655. http://www.gcow.wisc.edu/Gec/index.htm

Pseudomonas putida: Oligonucleotidos de 70mer representando 5539 ORFs de P.putida KT2440 http://www.progenica.com

Streptomyces lividans: 395 oligonucleótidos duplicados de Streptomyces lividans DNA array http://www.eurogentec.com

 

Qué necesitamos del usuario


Para organismos procariotas:
Se requiere un mínimo de 20 µg de RNA total por muestra una vez purificado por columna. La concentración mínima es de 200 ng/µl. La Unidad recomienda el envío de 50 µg puesto que hay diferentes requerimientos dependiendo del organismo en cuestión.

Para organismos eucariotas:
La cantidad que se requiere de cada muestra es un mínimo de 4 µg por muestra de RNAtotal purificado por columna a una concentración mínima de 200 ng/µl.
En casos donde la obtención de muestra sea complicada, consultar con la Unidad otras posibilidades.

*en el caso de tratar el RNA aislado con DNAsa, comunicarlo a la unidad. Se han dado casos de inhibición de reacciones posteriores.

Funcionamiento

El usuario enviará las muestras preprocesadas (ver requerimientos en el apartado de información) junto con el formulario de pedido debidamente cumplimentado. Usuarios externos al Centro Nacional de Biotecnología deberán también mandar el formulario vía email previamente al envío de muestras .


A su llegada a la unidad se procederá a la cuantificación de éstas así como a la determinación de su integridad por medio del bianalyzer2100. En caso que las muestras no pasen un mínimo de calidad exigible se le comunicará al usuario junto con una explicación y recomendaciones para la obtención de muestras adecuadas.
Si las muestras reúnen las condiciones adecuadas se procederá a su procesamiento normal.

Una vez terminado el experimento y obtenido los datos de su análisis éstos serán enviados al usuario. Las muestras sobrantes se eliminarán al mes de entregar los datos al usuario.


Cualquier duda o consulta acerca de este análisis podrá ser consultada tanto en persona, email o teléfono con la persona responsable de la ejecución del experimento.

 

Entrega de resultados

El análisis bioinformático se realizará mediante la aplicación de los algoritmos estadísticos más apropiados (LiMMA) y los resultados se suministrarán mediante una carpeta del visualizador FIESTA desarrollado en el Centro Nacional de Biotecnología (http://bioinfogp.cnb.csic.es)