LABORATORIOS DE  MICROFOTONICA
Departamento de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología
Universidad Autónoma de Madrid

CITOMETRIA DE FLUJO

Es una técnica que permite obtener información sobre poblaciones celulares a partir de un estudio individualizado de un gran número de células (habitualmente entre 5000 y 10000) que por tanto serán una muestra lo suficientemente representativa del conjunto poblacional. La suspensión de células en solución isotónica se hace pasar a través de un pequeño orificio de modo que cuando salen lo hacen una a una (en fila india) formando parte de una corriente continua o flujo cilíndrico.

Sobre esta corriente de células se hace incidir un haz de luz láser, cuya dispersión y reflexión son analizados en duración, intensidad y espectro, los datos obtenidos almacenados en memoria de ordenador y desde allí pasados a archivos binarios que posteriormente pueden ser analizados con detenimiento.

Fundamentos del citómetro de flujo

 

 

TIPOS DE ESTUDIOS CITOMETRICOS

Detección de células. El haz de luz laser cuando atraviesa una célula sufre una dispersión que puede ser evidenciada en un fotodetector, situado detrás de la corriente de células y justo enfrente de la fuente emisora, como una disminución de la luz incidente. El tiempo que dure el corte en la llegada de fotones al detector será proporcional al diámetro, y por tanto el volumen, celular. Este estudio de interrupción frontal del haz laser se denomina en términos anglosajones como Forward Scatter (FS).

Complejidad. Además del detector de luz situado frente al haz laser, existe otro grupo óptico, el más importante, que detecta la luz dispersada por las células y que se coloca formando un ángulo de 90º con el haz laser. Esta luz es descompuesta, mediante los filtros apropiados para poder estudiar tanto la dispersión de luz de la misma longitud de onda del laser como la emitida por los fluorocromos. La mayor o menor dispersión de la luz y por tanto la mayor o menor detección de luz en éste detector, será proporcional a la rugosidad de la superficie celular y a las estructuras y organelas celulares.

Fluorescencia. La luz dispersado pasa a través de espejos que reflejan fotones hasta longitudes de onda determinadas y dejan continuar a los de longitud de onda mayor de manera que es posible descomponer la luz en varios rangos de longitudes de onda que nos permiten estudiar rugosidad y dos o tres fluorescencias según los citómetros.

Esquema del funcionamiento de un citómetro de flujo

FUENTE DE LUZ

Aunque existen modelos antíguos de citómetros con fuente emisora de lámpara de arco, la casi totalidad de los modelos actuales llevan una fuente emisora laser. La luz emitida por el laser es una mezcla de longitudes de onda, conocidas como lineas laser, definidas por la energía emitida por el electrón al caer de una órbita alta a otra baja. La longitud de onda utilizadas en citofluorometría son 488, 568, 630 y 647 nm siendo la primera la más habitual. Los laser ultravioleta cada vez se usan menos debido a que han ido apareciendo fluorocromos excitables con luz visible que pueden sustituir perfectamente a los que solo se podían utilizar en UV.

Los citómetros de investigación suelen equipar varios láser, sin embargo los de rutina trabajan con longitud de onda del fija (casi siempre 488 nm).

Los emisores laser más empleados son los de helio-neón (atómicos), argon-kripton (iónicos) y helio-cadmio (moleculares). Recientemente se han empezado a introducir los basados en semiconductores (láser diodo).

 

FLUOROCROMOS

Son productos químicos que al ser estimulados con fotones con longitud de onda comprendida entre determinados rangos (de excitación) emiten a su vez otro fotón de longitud de onda mayor (de emisión). El prototipo es la fluoresceína que al ser estimulada con luz ultravioleta (no visible) emite luz de color verde (visible) aunque existen muchos otros como picoeritrina, rodamina, rojo de texas etc.

Fluorescencias múltiples. Es posible combinar a la vez dos o tres colorantes fluorescentes siempre que emitan en diferente longitud de onda y nuestro fluorómetro sea capaz de excitarlos a la vez y discriminar los fotones emitidos por ellos. Los colorantes más utilizados son la citada fluoresceína con excitación máxima a 495 nm y emisión máxima a 520 nm, y la picoeritrina con excitación a 495 y emisión a 576 nm lo que permite utilizarlos simultaneamente con un laser de 488 nm.

Un problema que presentan las dobles fluorescencias es el solapamiento de la emisión de los fluorocromos. La longitud de onda de la emisión fotónica, como todo proceso cuántico, no es rigurosamente exacta sino que sigue una distribución de gauss centrada sobre la longitud de emisión media, en otras palabras al descomponer la luz verde emitida por la fluoresceína siempre tiene algo de luz roja y azul. Por tanto cuando detectamos a la vez dos fluorescencias es muy posible que además de ser detectada la longitud de onda emitida por un fluorocromo con una alta intensidad, también sea detectada en otra longitud de onda de otro fluorocromo, aunque con menor intensidad. Este solapamiento se puede reducir en gran manera filtrando la luz con lo que el rango de longitud de onda que puede pasar es muy estrecho, pero pese a ello siempre existen fotones que se "cuelan" y que obligan a una corrección electrónica que hace que cuando se detectan una fluorescencia tipo 1, se eleve el umbral para detectar la fluorescencia 2 y viceversa. Esta elevación del umbral permitirá, no obstante, dejar pasar a los fotones provenientes de las verdaderas dobles fluorescencias. En la gráfica 2 se pueden apreciar las longitudes de onda de emisión de fluoresceina y picoeritrina con sus correspondientes solapamientos y las zonas de lectura del espectro tras los correspondientes filtrados, en sombreado se puede ver el solapamiento de las emisiones producido aún después del filtrado.

 

MARCAJE DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES

IDEA GENERAL

Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales de rata contra antígenos concretos en la supercicie de las células, marcadas con colorantes fluorescentes verde (fluoresceina) y/o rojo (picoeritrina). El anticuerpo es enfrentado a las células durante media hora, luego se lava y se procesa por el citómetro de flujo.

RUIDO CUANTICO

Al analizar los resultados, siempre nos vamos a encontrar con una fluorescencia inespecífica que se produce por adsorción de algunas moléculas de anticuerpo a la superficie celular sin mediar un reconocimiento antígeno anticuerpo. Para evitar la interferencia de la positividad inespecífica en los resultados es preciso cuantificar y eliminar dicho ruido de fondo (control negativo), para ello las muestras deben ser tratadas con un anticuerpo del mismo animal que el utilizado para los marcajes (suelen ser de rata), marcado con el mismo colorante pero que no es específico, es decir no reconoce ninguna de las moléculas de superficie y se unirá por un mecanismo distinto de la unión antígeno anticuerpo, la fluorescencia que se obtenga con este anticuerpo nos permite cuantificar ese ruido cuántico y poder establecer el umbral por encima del cual se considere que el resultado no se debe a inespecificidad sino a la fijación del anticuerpo.

 

TECNICAS BASICAS DE MARCAJE CELULAR

A continuación se detalla la técnica de rutina para evaluar moléculas de superficie en células sanguíneas mediante anticuerpos marcados con fluorocromos. Las diluciones que se indican son a título orientativo, deben ajustarse para cada antígeno y tipo celular concreto.

ANTICUERPOS DIRECTOS.
Se utilizan anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos concretos que vienen ya marcados con el fluorocromo en su presentación comercial.
1.- En un tubo seco  colocar 100 µl de una solución celular de 10 Mc/ml (1 Mc).
2.- Controles .- Añadir el anticuerpo marcado generalmente se ponen 20 µl excepto para los de ruido de fondo que son uso 1:40 en 15 µl.
3.- Colocar los tubos en hielo picado y trasladar a nevera, incubar 30 minutos.
4.- Extraer las muestras del frio, añadir 3,5 ml de solución de Hanks, centrifugar a 1800 rpm, descartar el sobrenadante, resuspender y añadir 500 µl de solución de Hanks. Las muestras ya están listas para pasar por el citómetro de flujo.
 
ANTICUERPOS INDIRECTOS.
Habitualmente los anticuerpos contra los principales marcadores de superficie ya vienen conjugados con  fluorocromos. Para buscar marcadores poco comunes o en experimentación no siempre es posible disponer de dicho anticuerpo conjugado en presentaciones comerciales en esos casos se debe de usar el anticuerpo sin conjugar y detectar la fijación del mismo a través de  marcaje indirecto, se trata de enfrentar el anticuerpo específico (no conjugado) contra el antígeno buscado, se lava para retirar el no fijado y a continuación se añade un segundo anticuerpo conjugado con fluorocromo que reconoce como antígeno al primer anticuerpo:
1.  Enfrentar las células 30 minutos a 4ºC con el primer anticuerpo (1:40, por ejemplo).
2.  Lavar dos veces con solución de Hanks para retirar los restos del anticuerpo.
3.  Resuspender las células y añadir 4 µl del anticuerpo anti-ratón (si el primario era de ratón) marcado. Incubar otros  30 minutos a 4ºC.
4.  Lavar las células con solución de Hanks y resuspender como si se tratase de un marcaje directo en un volumen final de unos 400 µl.

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